WESTERN BLOTT
¡Los conceptos de importancia serán subrayados!
Dentro de las aplicaciones de la electroforesis encontramos tres técnicas que toman importancia en este momento, nos referimos entonces a SOTHERN BLOTT (ADN), NOTHER BLOTT (RNA) Y WESTERN BLOTT (PROTEINAS).
El SOTHERN BLOTT es una técnica se basa en la propiedad que tiene el ADN de migrar atravez de un gel de electroforesisaprovechando la cargas negativas que generan los grupos fosfatos. (Ver figura 1) Por tanto esta técnica inicia a través de una muestra que puede ser sangre- semen-saliva pues lo que buscamos es ADN. El ADN debe recibir un tratamiento con endonucleasa para así fragmentarlo y permitir su corrida atravez del agar, (recuerden que la corrida electroforética se basa en la capacidad de la moléculanegativa de buscar su polo contrario, así mismo las moléculas de mayor tamaño serán retenidas al inicio y las de menor tamaño difundirán fácilmente). Una vez se tiene la electroforesis del ADN, este se desnaturaliza en disolución alcalina para obtenerlo de forma monocatenario. Luego se relaiza la electrotranferencia (este concepto se profundizara mas adelante) a una membrana de nailon. Una vez en lamembran se agrega una sonda radioactiva que es complementaria a una secuencia específica de ADN ¡de ahí la importancia de monocatenario! Permitiendo identificar si el paciente presenta el gen de interés, por lo que este tipo de técnicas son tan especificas. El revelado, permite visualizar la reacción de la sonda con el ADN, puesto que la reacción no la podemos ver a simple vista por lo quenecesitamos realizar una técnica llamada autoradigrafia. Esta técnica permite detectar moléculas marcadas radioactivamente, para tal fin se utilizan emulsiones o placas fotográficas sensibles a la radiación, de forma tal que la plata que contiene la emulsión precipita en presencia de la radiación como plata metálica, permitiendo observar las bandas en la placa. una banda representa que existen genesespecificos en el paciente (“positivo”), si no existen bandas es que no hay genes de interés por tanto será “negativo”. EL NOTHERN BLOTT es una técnica similar al Sothern, solo que no buscamos ADN, trabajamos es con RNA, que al igual que el ADN tiene cargas negativas por lo que en estas técnicas no son necesarios los componentes como el SDS .
WESTERN BLOTT, ( ver video immunoblott)es una técnicaque se basa en la electrotransfrecencia de las proteínas hacia una membrana sintética , seguido de una detección de las proteínas por un proceso de tinción de blott (Ac-enzima-sustrato) , es decir que el Western Blott aprovecha las propiedades que confiere el SDS a las proteínas, para realizar la transferencia de las proteínas desde el gel de poliacrilamida a las membranas sintéticas,fundamentándose en el principio de la electroforesis . Las proteínas negativas que se encuentran ubicadas en el gel de poliacrilamida seguirán hacia el ánodo (+), permitiendo la movilización en las membranas. Una vez se encuentren las proteínas en la membrana, se realiza la detección de estas por medio de anticuerpos específicos contra la proteínas que son de nuestro interés o de valor diagnostico. Losanticuerpos se encuentran marcados con una enzima que permitirá observar las bandas cuando la pongo en presencia de un sustrato. Si el sustrato se observara a simple vista es Cromogenico, si es de tipo Fluorescente se deberá utilizar una cámara CCD para su revelado, y por ultimo si el sustrato es Quimioluminiscente se utiliza técnicas como la autoradiografia para el revelado.
Recomendable vereste video: http://www.youtube.com/watch?v=nqspgMGNsrU&feature=related
Los pasos importantes en un Western blott son los siguientes:
ELECTROTRANSFERENCIA: si bien la electrotransfrecencia es el proceso en el cual realizamos la transferencias de las proteínas que se encuentran en el gel de poliacrilamida a una membrana sintética. Debemos tener en cuenta varios aspectos; en primer lugar la…
